ما هي الانزيمات في تعريف الكيمياء. الانزيمات. التنظيم الهيكلي والوظيفي للإنزيمات

الطبيعة الكيميائية للإنزيمات. أهمية الإنزيمات لحياة الجسم.

7.1.1. يتم تحديد مسار عمليات التمثيل الغذائي في الجسم من خلال عمل العديد من الإنزيمات - المحفزات البيولوجية ذات الطبيعة البروتينية. تعمل على تسريع التفاعلات الكيميائية دون أن يتم استهلاكها. شرط "إنزيم"يأتي من الكلمة اللاتينية خميرة - العجين المخمر. جنبا إلى جنب مع هذا المفهوم، يتم استخدام المصطلح المعادل في الأدب "إنزيم" (إنزيم - في الخميرة) أصل يوناني. ومن هنا فإن فرع الكيمياء الحيوية الذي يدرس الإنزيمات يسمى "علم الإنزيمات".

علم الإنزيمات يشكل الأساس للمعرفة على المستوى الجزيئي لأهم مشاكل فسيولوجيا الإنسان وعلم الأمراض. هضم العناصر الغذائية واستخدامها لإنتاج الطاقة، وتكوين المكونات الهيكلية والوظيفية للأنسجة، وتقلص العضلات، ونقل الإشارات الكهربائية على طول الألياف العصبية، وإدراك الضوء بالعين، وتجلط الدم - كل من هذه الآليات الفسيولوجية هي بناءً على العمل التحفيزي لبعض الإنزيمات. لقد ثبت أن العديد من الأمراض تضعف بشكل مباشر التحفيز الأنزيمي؛ تحديد نشاط الانزيم في الدم والأنسجة الأخرى يعطي معلومات قيمةللتشخيص الطبي. يمكن استخدام الإنزيمات أو مثبطاتها المواد الطبية. وهكذا المعرفة أهم الميزاتتعد الإنزيمات والتفاعلات التي تحفزها ضرورية لاتباع نهج عقلاني لدراسة الأمراض التي تصيب الإنسان وتشخيصها وعلاجها.

7.1.2. تسمى المواد التي يتم تحفيز تحولاتها بواسطة الإنزيمات ركائز . يتحد الإنزيم مع الركيزة لتكوينه مجمع الانزيم الركيزة (الشكل 7.1).

الشكل 7.1.تكوين مركب إنزيم-ركيزة أثناء التفاعل المحفز.

يساعد تكوين هذا المركب على تقليل حاجز الطاقة الذي يجب على جزيء الركيزة التغلب عليه للدخول في التفاعل (الشكل 7.2). عند الانتهاء من التفاعل، يتحلل مركب الإنزيم والركيزة إلى منتج (منتجات) وإنزيم. في نهاية التفاعل، يعود الإنزيم إلى حالته الأصلية ويمكنه التفاعل مع جزيء ركيزة جديد.

الشكل 7.2.تأثير الإنزيم على حاجز الطاقة للتفاعل. تعمل الإنزيمات، من خلال عملها كمحفزات، على خفض طاقة التنشيط اللازمة لحدوث التفاعل.

7.1.3. تتميز الإنزيمات بالخصائص مشترك بين جميع البروتينات. على وجه الخصوص، جزيئات الإنزيم، مثل البروتينات الأخرى، مبنية من أحماض ألفا أمينية متصلة بواسطة روابط الببتيد. لذلك، تعطي حلول الانزيم رد فعل إيجابي البيوريت، وتحللها - تفاعل النينهيدرين الإيجابي. يتم تحديد الخصائص والوظائف الأصلية للإنزيمات من خلال وجود بنية مكانية معينة (التشكل) لسلسلة البولي ببتيد الخاصة بها. تغيير هذا الهيكل نتيجة لذلك تمسخ الحرارييؤدي إلى فقدان الخصائص التحفيزية. إن وجود الوزن الجزيئي العالي في الإنزيمات يحدد وجودها عدم القدرة على غسيل الكلىووجود مجموعات وظيفية مشحونة في الجزيئات هو التنقل في المجال الكهربائي. مثل البروتينات الأخرى، تشكل الإنزيمات محاليل غروانية، منها يمكن ترسيبه بواسطة الأسيتون والكحول وكبريتات الأمونيوم- المواد التي تساهم في تدمير غلاف الماء وتحييد الشحنة الكهربائية.

الخصائص الأساسية للإنزيمات. قلة الديناميكية وعكس عمل الإنزيم. تأثير تركيز الإنزيم والركيزة ودرجة الحرارة ودرجة الحموضة في البيئة على معدل التفاعل الأنزيمي.

7.2.1. تحدد الطبيعة البروتينية للإنزيمات ظهور عدد من الخصائص فيها والتي لا تتميز عمومًا بالمحفزات غير العضوية: ديناميكا القلة، والنوعية، واعتماد معدل التفاعل على درجة الحرارة، ودرجة الحموضة للوسط، وتركيز الإنزيم والركيزة، ووجود المنشطات والمثبطات.

تحت قلة الديناميكيةالإنزيمات فعالة للغاية بكميات صغيرة جدًا. تفسر هذه الكفاءة العالية بحقيقة أن جزيئات الإنزيم تتجدد باستمرار أثناء نشاطها التحفيزي. يمكن لجزيء إنزيم نموذجي أن يتجدد ملايين المرات في الدقيقة. يجب أن أقول إن المحفزات غير العضوية قادرة أيضًا على تسريع تحويل كمية من المواد أكبر بعدة مرات من كتلتها. ولكن لا يوجد محفز غير عضوي يمكن مقارنته بالإنزيمات من حيث الكفاءة.

ومن الأمثلة على ذلك إنزيم الرينين، الذي ينتج عن الغشاء المخاطي في المعدة لدى الحيوانات المجترة. جزيء واحد منه خلال 10 دقائق عند 37 درجة مئوية قادر على التسبب في تخثر (تخثر) حوالي مليون جزيء من كازينوجين الحليب.

مثال آخر على الكفاءة العالية للإنزيمات هو الكاتلاز. جزيء واحد من هذا الإنزيم عند 0 درجة مئوية يكسر حوالي 50000 جزيء من بيروكسيد الهيدروجين في الثانية:

2 ن 2 O2 2 H2 O + O2

تأثير الكاتالاز على بيروكسيد الهيدروجين هو تغيير طاقة التنشيط لهذا التفاعل من حوالي 75 كيلوجول/مول بدون محفز إلى 21 كيلوجول/مول في وجود الإنزيم. إذا تم استخدام البلاتين الغروي كمحفز لهذا التفاعل، فإن طاقة التنشيط تكون 50 كيلوجول/مول فقط.

7.2.2. عند دراسة تأثير أي عامل على معدل التفاعل الأنزيمي، يجب أن تظل جميع العوامل الأخرى دون تغيير، وإذا أمكن، يكون لها قيمة مثالية.

يتم قياس معدل التفاعلات الأنزيمية من خلال كمية الركيزة المحولة لكل وحدة زمنية، أو كمية المنتج المتكون. يتم تغيير السرعة في المرحلة الأولية من التفاعل، عندما يكون المنتج غائبًا عمليًا ولا يحدث رد فعل عكسي. بالإضافة إلى ذلك، في المرحلة الأولية من التفاعل، يتوافق تركيز الركيزة مع الكمية الأصلية.

7.2.3. الاعتماد على معدل التفاعل الأنزيمي ( الخامس ) على تركيز الانزيم [ه](الشكل 7.3). عند تركيز عالي من الركيزة (أضعاف تركيز الإنزيم) وبقاء عوامل أخرى ثابتة، يتناسب معدل التفاعل الأنزيمي مع تركيز الإنزيم. لذلك، بمعرفة معدل التفاعل المحفز بواسطة الإنزيم، يمكننا استخلاص استنتاج حول كميته في المادة قيد الدراسة.

الشكل 7.3.اعتماد معدل التفاعل الأنزيمي على تركيز الإنزيم

7.2.4. اعتماد معدل التفاعل على تركيز الركيزة[س]. يبدو الرسم البياني للتبعية مثل القطع الزائد (الشكل ٧.٤). عند تركيز إنزيم ثابت، يزداد معدل التفاعل المحفز مع زيادة تركيز الركيزة حتى القيمة القصوى Vmax، وبعدها يظل ثابتًا. وينبغي تفسير ذلك من خلال حقيقة أنه عند التركيزات العالية من الركيزة، ترتبط جميع المراكز النشطة لجزيئات الإنزيم بجزيئات الركيزة. يمكن لأي ركيزة زائدة أن تتحد مع الإنزيم فقط بعد تكوين منتج التفاعل وتحرير الموقع النشط.

الشكل 7.4.اعتماد معدل التفاعل الأنزيمي على تركيز الركيزة.

يمكن التعبير عن اعتماد معدل التفاعل على تركيز الركيزة بواسطة معادلة ميكايليس-مينتن:

,

حيث V هو معدل التفاعل عند تركيز الركيزة [S]، Vmax هو الحد الأقصى للسرعة وKM هو ثابت ميكايليس.

ثابت ميكايليس يساوي تركيز الركيزة الذي يكون عنده معدل التفاعل نصف الحد الأقصى. يعد تحديد KM وVmax ذا أهمية عملية كبيرة، لأنه يسمح للمرء بالوصف الكمي لمعظم التفاعلات الأنزيمية، بما في ذلك التفاعلات التي تتضمن ركيزتين أو أكثر. المواد الكيميائية المختلفة التي تغير نشاط الإنزيم لها تأثيرات مختلفة على قيم Vmax وKM.

7.2.5. اعتماد معدل التفاعل على t - درجة الحرارة التي يحدث عندها التفاعل (الشكل 7.5) معقدة. تمثل قيمة درجة الحرارة التي يكون عندها معدل التفاعل الحد الأقصى درجة الحرارة المثلى للإنزيم. تبلغ درجة الحرارة المثلى لمعظم الإنزيمات في جسم الإنسان حوالي 40 درجة مئوية. بالنسبة لمعظم الإنزيمات، تكون درجة الحرارة المثالية مساوية أو أعلى من درجة الحرارة التي توجد بها الخلايا.

الشكل 7.5.اعتماد معدل التفاعل الأنزيمي على درجة الحرارة.

مع المزيد درجات الحرارة المنخفضة(0° - 40°C) يزداد معدل التفاعل مع زيادة درجة الحرارة. وعندما ترتفع درجة الحرارة بمقدار 10 درجات مئوية، يتضاعف معدل التفاعل الأنزيمي (معامل درجة الحرارة Q10 هو 2). يتم تفسير الزيادة في معدل التفاعل من خلال زيادة الطاقة الحركية للجزيئات. مع زيادة أخرى في درجة الحرارة، يتم كسر الروابط التي تدعم البنية الثانوية والثالثية للإنزيم، أي تمسخ الحرارة. ويرافق ذلك فقدان تدريجي للنشاط التحفيزي.

7.2.6. اعتماد معدل التفاعل على الرقم الهيدروجيني للوسط (الشكل 7.6). عند درجة حرارة ثابتة، يعمل الإنزيم بكفاءة أكبر ضمن نطاق ضيق من الرقم الهيدروجيني. تمثل قيمة الرقم الهيدروجيني التي يكون عندها معدل التفاعل الحد الأقصى الرقم الهيدروجيني الأمثل للإنزيم. تتمتع معظم الإنزيمات الموجودة في جسم الإنسان بدرجة حموضة مثالية ضمن نطاق درجة الحموضة 6 - 8، ولكن هناك إنزيمات تنشط عند قيم درجة الحموضة خارج هذا النطاق (على سبيل المثال البيبسين الذي يكون أكثر نشاطًا عند درجة الحموضة 1.5 - 2.5). .

يؤدي التغير في الرقم الهيدروجيني، سواء في الاتجاهين الحمضي والقلوي عن المستوى الأمثل، إلى تغير في درجة تأين المجموعات الحمضية والأساسية من الأحماض الأمينية التي يتكون منها الإنزيم (على سبيل المثال، مجموعات COOH من الأسبارتات والغلوتامات، مجموعات NH2 من الليسين، وما إلى ذلك). يؤدي هذا إلى تغيير في تكوين الإنزيم، مما يؤدي إلى تغيير في البنية المكانية للمركز النشط وانخفاض في تقاربه مع الركيزة. بالإضافة إلى ذلك، عند قيم الرقم الهيدروجيني القصوى، يتم تغيير طبيعة الإنزيم وتعطيله.

الشكل 7.6.اعتماد معدل التفاعل الأنزيمي على الرقم الهيدروجيني للوسط.

تجدر الإشارة إلى أن خاصية الرقم الهيدروجيني الأمثل للإنزيم لا تتطابق دائمًا مع الرقم الهيدروجيني لبيئته المباشرة داخل الخلايا. وهذا يشير إلى أن البيئة التي يوجد فيها الإنزيم تنظم نشاطه إلى حد ما.

7.2.7. اعتماد معدل التفاعل على وجود المنشطات والمثبطات . تزيد المنشطات من معدل التفاعل الأنزيمي. مثبطات تقلل من معدل التفاعلات الأنزيمية.

يمكن للأيونات غير العضوية أن تعمل كمنشطات للإنزيمات. من المعتقد أن هذه الأيونات تجعل الإنزيم أو جزيئات الركيزة تتبنى شكلاً يشجع على تكوين مركب إنزيم-ركيزة. وهذا يزيد من احتمالية التفاعل بين الإنزيم والركيزة، وبالتالي معدل التفاعل المحفز بواسطة الإنزيم. على سبيل المثال، يزداد نشاط الأميليز اللعابي في وجود أيونات الكلوريد.

خصوصية عمل الإنزيم (المطلق والنسبي والكيميائي الفراغي).

7.3.1. خاصية هامةما يميز الإنزيمات عن المحفزات غير العضوية هو خصوصية العمل. كما هو معروف، فإن بنية المركز النشط للإنزيم مكملة لبنية الركيزة الخاصة به. لذلك، يختار الإنزيم ويربط فقط الركيزة الخاصة به من جميع المواد الموجودة في الخلية. تتميز الإنزيمات بالخصوصية ليس فقط فيما يتعلق بالركيزة، ولكن أيضًا فيما يتعلق بمسار تحويل الركيزة.

تتمتع الإنزيمات بخصوصية مطلقة ونسبية وكيميائية مجسمة.

7.3.2. خصوصية مطلقة- القدرة الانتقائية للإنزيم على تحفيز واحد فقط من التحولات المحتملة لركيزة واحدة. يمكن تفسير ذلك من خلال التكامل المطابق والكهروستاتيكي لجزيئات الركيزة والإنزيم.

على سبيل المثال، يحفز إنزيم الأرجيناز فقط التحلل المائي للحمض الأميني أرجينين، بينما يحفز إنزيم اليورياز فقط تحلل اليوريا ولا يعمل على ركائز أخرى.

7.3.3. الخصوصية النسبية- القدرة الانتقائية للإنزيم على تحفيز التحولات المماثلة للركائز ذات البنية المماثلة.

تعمل هذه الإنزيمات على نفس المجموعات الوظيفية أو على نفس النوع من الروابط في جزيئات الركيزة. على سبيل المثال، تعمل الإنزيمات المائية المختلفة على نوع معين من الروابط:

• الأميليز - على روابط جليكوسيدية.
• البيبسين والتربسين - للروابط الببتيدية.
• الليباز والفوسفوليباز - في روابط استر.

يمتد عمل هذه الإنزيمات إلى عدد كبير من الركائز، مما يسمح للجسم بالتعامل مع كمية صغيرة من الإنزيمات الهاضمة - وإلا فسيحتاج إلى المزيد.

7.3.4. الخصوصية الكيميائية المجسمة (البصرية).- القدرة الانتقائية للإنزيم على تحفيز تحويل واحد فقط من الأيزومرات المكانية المحتملة للركيزة.

وهكذا، فإن معظم إنزيمات الثدييات تحفز تحويل أيزومرات L من الأحماض الأمينية فقط، وليس أيزومرات D. على العكس من ذلك، تحفز الإنزيمات المشاركة في استقلاب السكريات الأحادية تحويل السكريات الفوسفاتية D فقط، وليس L. إن إنزيمات الجليكوسيداز ليست محددة فقط لجزء السكريات الأحادية، ولكن أيضًا لطبيعة الرابطة الجليكوسيدية. على سبيل المثال، يشق α-amylase روابط α-1,4-glycosidic في جزيء النشا، لكنه لا يعمل على روابط α-1,2-glycosidic في جزيء السكروز.

المبادئ الأساسية التي يقوم عليها التصنيف الحديث وتسمية الإنزيمات.

7.4.1. حاليًا، من المعروف أكثر من ألفي تفاعل كيميائي محفز بواسطة الإنزيمات، وهذا العدد في تزايد مستمر. للتنقل في العديد من التحولات. كانت هناك حاجة ملحة لتصنيف منهجي وتسميات يمكن من خلالها تحديد أي إنزيم بدقة. كانت التسميات المستخدمة حتى منتصف القرن العشرين بعيدة كل البعد عن الكمال. عندما اكتشف الباحثون إنزيمًا جديدًا، أطلقوا عليه اسمًا حسب تقديرهم، الأمر الذي أدى حتماً إلى الارتباك وكل أنواع التناقضات. تبين أن بعض الأسماء خاطئة، والبعض الآخر لم يقل شيئًا عن طبيعة التفاعل المحفز. غالبا ما يستخدم العلماء من مدارس مختلفة أسماء مختلفةلنفس الإنزيم أو، على العكس من ذلك، نفس الاسم لعدة إنزيمات مختلفة.

تقرر تطوير عقلاني التصنيف الدوليوتسميات الإنزيمات التي يمكن لعلماء الكيمياء الحيوية استخدامها في جميع البلدان. ولهذا الغرض، تم إنشاء لجنة الإنزيمات في إطار الاتحاد الدولي للكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية (IUВMB)، الذي اقترح المبادئ الأساسية لهذا التصنيف والتسميات في عام 1964. يتم تحسينها واستكمالها باستمرار؛ حاليًا، الطبعة السادسة من هذه التسمية سارية المفعول (1992)، والتي يتم نشر الإضافات إليها سنويًا.

الأكسدة.

الى الصف الأكسدة تشمل الإنزيمات التي تحفز تفاعلات الأكسدة والاختزال. المخطط العامويمكن تمثيلها على النحو التالي:

حيث AH2 مانح للهيدروجين، B هو متقبل للهيدروجين. في الكائنات الحية، تحدث الأكسدة في المقام الأول من خلال استخلاص ذرات الهيدروجين أو الإلكترونات من الركائز المانحة. يمكن أن تكون مواد مختلفة متقبلة لذرات الهيدروجين أو الإلكترونات - الإنزيمات المساعدة (NAD، NADP، FAD، FMN، الجلوتاثيون، حمض ليبويك، يوبيكوينون)، السيتوكروم. بروتينات الحديد والكبريت والأكسجين.

تتشكل الفئات الفرعية من إنزيمات الأكسدة والاختزال اعتمادًا على طبيعة المجموعة الوظيفية للمانح الهيدروجين (الإلكترونات). في المجموع هناك 19 فئة فرعية. أهمها ما يلي:

تعمل الأكسدة المؤكسدة على مجموعة الجهات المانحة CH-OH. تتأكسد الإنزيمات التي تنتمي إلى هذه الفئة الفرعية مجموعات الكحولإلى مجموعات الألدهيد أو الكيتون. ومن الأمثلة على ذلك الانزيم هيدروجيناز الكحول (الكحول: أوكسيدوريدوكتاس NAD؛ المفوضية الأوروبية 1.1.1.1). يشارك في استقلاب الإيثانول في الأنسجة:

بالإضافة إلى أكسدة الكحول، وتشارك إنزيمات هذه الفئة الفرعية في نزع الهيدروجين من أحماض الهيدروكسي (اللاكتيك، الماليك، إيزوسيتريك)، والسكريات الأحادية والمركبات الأخرى التي تحتوي على مجموعات الهيدروكسيل.

تعمل الأكسدة المؤكسدة على مجموعة الألدهيد أو الكيتون من الجهات المانحة. تعمل هذه الإنزيمات على أكسدة الألدهيدات والكيتونات إلى أحماض كربوكسيلية. على سبيل المثال، ممثل هذه الفئة الفرعية - جليسرالديهايد-3-فوسفات ديهيدروجينيز (D-glyceraldehyde-3-phosphate: NAD-oxyoreductase (الفسفرة)، EC 1.2.1.12) - يحفز أحد التفاعلات الوسيطة لتحلل الجلوكوز:

من المهم ملاحظة أن ناتج هذا التفاعل يحتوي على رابطة فوسفات غنية بالطاقة عند الموضع 1. يمكن نقل بقايا حمض الفوسفوريك التي تشكل هذه الرابطة من 1،3-ثنائي فسفوغليسيرات إلى ADP لتكوين ATP (انظر أدناه).

تعمل الأكسدة المؤكسدة على مجموعة الجهات المانحة CH-CH. ونتيجة للتفاعلات التي تحفزها، يتم تحويل مجموعات CH-CH إلى مجموعات C=C. أي أنه يحدث تكوين مركبات غير مشبعة من مركبات مشبعة. على سبيل المثال، إنزيم في دورة حمض ثلاثي الكربوكسيل سكسينات ديهيدروجينيز (السكسينات: متقبل - مؤكسد، EC 1.3.99.1) يسرع أكسدة حمض السكسينيك بتكوين حمض الفوماريك غير المشبع:

تعمل الأكسدة والاختزال على CH-NH2 - مجموعة المانحين. تحفز هذه الإنزيمات عملية الأكسدة للأحماض الأمينية والأمينات الحيوية. يتم تحويل الأمينات إلى ألدهيدات أو كيتونات، والأحماض الأمينية إلى أحماض كيتو، ويتم إطلاق الأمونيا. لذا، نازعة هيدروجين الغلوتامات (L-غلوتامات: NAD(P) - أكسيدوريدوكتيز (تبليل)، EC 1.4.1.3) يشارك في التحول التالي للغلوتامات:

تعمل الأكسدة المؤكسدة على مجموعات الجهات المانحة المحتوية على الكبريت تحفيز أكسدة مجموعات الثيول (سولفيدريل) إلى مجموعات ثاني كبريتيد، والكبريتات إلى كبريتات. مثال على الانزيم هو ثنائي هيدروليبويل ديهيدروجينيز (EC 1.8.1.4)، تحفيز أحد التفاعلات الوسيطة لنزع الكربوكسيل المؤكسد من البيروفات:

إنزيمات الأكسدة، التي تعمل على بيروكسيد الهيدروجين كمستقبل، وهي قليلة العدد نسبيًا ويتم دمجها في فئة فرعية منفصلة، ​​تُعرف أيضًا باسم تافه البيروكسيداز. مثال على الانزيم هو الجلوتاثيون بيروكسيديز (الجلوتاثيون: H2 O2 - مؤكسد. EC 1.11.1.9)، يشارك في تثبيط بيروكسيد الهيدروجين في كريات الدم الحمراء والكبد وبعض الأنسجة الأخرى:

تعمل الأكسدة المؤكسدة على زوج من الجهات المانحة مع تضمين الأكسجين الجزيئي، أو أحاديات الأكسجين - الإنزيمات التي تحفز أكسدة المركبات العضوية بواسطة الأكسجين الجزيئي، مما يؤدي إلى ضم إحدى ذرات الأكسجين في جزيئات هذه المركبات. في هذه الحالة، يتم تضمين ذرة الأكسجين الثانية في جزيء الماء. هذه هي الطريقة التي يتم بها تحفيز تفاعل الفينيل ألانين مع التيروزين فينيل ألانين 4-أحادي الأكسجين (كف 1.14.16.1):

في بعض الأشخاص، يؤدي الخلل الوراثي في ​​هذا الإنزيم إلى مرض يسمى بيلة الفينيل كيتون.

تشتمل إنزيمات الأكسدة الأحادية أيضًا على إنزيم يعرف باسم السيتوكروم ص 450 (EC 1.14.14.1) يوجد بشكل رئيسي في خلايا الكبد ويقوم بعملية الهيدروكسيل للمركبات المحبة للدهون الغريبة عن الجسم، والتي تتشكل على شكل المنتجات الثانويةردود الفعل أو دخول الجسم من الخارج. على سبيل المثال، الإندول، الذي يتكون من التربتوفان نتيجة لنشاط الكائنات الحية الدقيقة المعوية، يخضع لعملية الهيدروكسيل في الكبد وفقا للمخطط التالي:

يزيد ظهور مجموعة الهيدروكسيل من محبة المواد للماء ويسهل إزالتها لاحقًا من الجسم. بالإضافة إلى ذلك، يشارك السيتوكروم P450 في مراحل معينة من تحويل الكوليسترول وهرمونات الستيرويد. إن وجود نظام السيتوكروم P450 عالي الكفاءة في الكائنات الحية يؤدي في بعض الحالات إلى عواقب عملية غير مرغوب فيها: فهو يقلل من الوقت الذي يقضيه في جسم الإنسان الأدويةوبالتالي يقلل من تأثيرها العلاجي.

إنزيمات الأكسدة التي تعمل على جهة مانحة واحدة مع تضمين الأكسجين الجزيئي، أو ديوكسيجيناز, تحفيز التحولات التي يتم خلالها تضمين ذرات جزيء O2 في تكوين الركيزة المؤكسدة. على سبيل المثال، في عملية تقويض الفينيل ألانين والتيروزين، يتكون مالييلاسيتواسيتات من حمض الهوموجنتيسيك، والذي يتضمن ذرتي الأكسجين:

يسمى الإنزيم الذي يحفز هذا التفاعل هوموجنتيزات 1،2-ديوكسيجيناز(كف 1.13.11.5). وفي بعض الحالات يحدث نقص خلقي لهذا الإنزيم، مما يؤدي إلى تطور مرض يسمى بيلة الكابتون.

التحويلات.

حيث X هي المجموعة الوظيفية المنقولة. AX هو المتبرع بالمجموعة، B هو المتقبل. يعتمد التقسيم إلى فئات فرعية على طبيعة المجموعات التي يتم نقلها.

الناقلات التي تنقل شظايا الكربون الواحد. تتضمن هذه الفئة الفرعية إنزيمات تعمل على تسريع نقل الميثيل (-CH3)، والميثيلين (-CH2-)، والميثينيل (-CH=)، والفورميل والمجموعات ذات الصلة. نعم بالمشاركة جوانيدين خلات ميثيل ترانسفيراز (S-adenosylmethionine guanidine acetate methyltransferase، EC 2.1.1.2) يحدث التوليف بيولوجيًا المادة الفعالةالكرياتين:

إنزيمات النقل التي تنقل بقايا حمض الكربوكسيل (أسيل ترانسفيراز). إنها تحفز مجموعة متنوعة من العمليات الكيميائية المرتبطة بنقل بقايا الأحماض المختلفة (الخليك، البالمتيك، إلخ) بشكل رئيسي من الإنزيم المساعد ثيوسترات إلى متقبلات مختلفة. مثال على تفاعل تبادل الأسيتيل هو تكوين الوسيط أستيل كولين بالمشاركة الكولين أسيتيل ترانسفيراز (أسيتيل-CoA: الكولين-O-أسيتيل ترانسفيراز، EC 2.3.1.6):

إنزيمات النقل التي تنقل بقايا الجليكوزيل (ناقلات الجليكوزيل) تحفيز نقل بقايا الجليكوزيل من جزيئات استر الفوسفور إلى جزيئات السكريات الأحادية والسكريات والمواد الأخرى. تلعب هذه الإنزيمات، على وجه الخصوص، دورًا رئيسيًا في تخليق الجليكوجين والنشا، وكذلك في المرحلة الأولى من تدميرها. إنزيم آخر من هذه الفئة الفرعية - UDP-جلوكورونيل ترانسفيراز (UDP-غلوكورونات-غلوكورونيل ترانسفيراز (غير خاص بالحوض)، EC 2.4.1.17) - يشارك في عمليات تحييد المواد السامة الداخلية والخارجية في الكبد:

الناقلات التي تنقل المجموعات النيتروجينية. تتضمن هذه الفئة الفرعية ناقلات الأمين, تسريع نقل مجموعة ألفا أمينو من الأحماض الأمينية إلى ذرة الكربون ألفا في أحماض الكيتو. وأهم هذه الإنزيمات ألانين أمينوترانسفيراز (L-ألانين: 2-أوكسوجلوتارات أمينوترانسفيراز، EC 2.6.1.2). التفاعل المحفز:

إنزيمات النقل التي تنقل مجموعات الفوسفات (ناقلات الفوسفات). هذه المجموعة من الإنزيمات تحفز العمليات البيوكيميائية، المرتبطة بنقل بقايا حمض الفوسفوريك إلى ركائز مختلفة. هذه العمليات لديها مهملحياة الجسم، لأنها تضمن تحويل عدد من المواد إلى فوسفوسترات عضوية، والتي لها نشاط كيميائي عالي وتدخل بسهولة في التفاعلات اللاحقة. يُطلق على ناقلات الفوسفات التي تستخدم ATP كمتبرع للفوسفات اسم شائع كيناز . الانزيم الموزع على نطاق واسع هو هيكسوكيناز (ATP:D-hexose-6-phosphotransferase. EC 2.7.1.1.)، تسريع نقل مجموعة الفوسفات من ATP إلى السكريات الأحادية:

في بعض الحالات، من الممكن أيضًا النقل العكسي لمجموعة الفوسفات من الركيزة إلى ADP مع تكوين ATP. نعم الانزيم كيناز فوسفوجليسرات (ATP: D-3-phosphoglycerate-1-phosphotransferase، EC 2.7.2.3) يحول المذكور سابقًا (انظر "Oxidoreductase") 1.3-diphosphoglycerate:

تسمى التفاعلات المماثلة لفسفرة ADP مع تكوين ATP، إلى جانب تحويل الركيزة (وليس مع نقل الإلكترونات في السلسلة التنفسية). تفاعلات الفسفرة الركيزة. ويزداد دور هذه التفاعلات في الخلية بشكل ملحوظ مع نقص الأكسجين في الأنسجة.

هيدرولاز.

Hydrolases هي فئة من الإنزيمات التي تحفز تحلل المركبات العضوية بمشاركة الماء (تفاعلات التحلل المائي). تتم هذه التفاعلات وفقًا للمخطط التالي:

حيث A-B مركب معقد، A-H وB-OH هما نواتج تحلله المائي. ردود الفعل من هذا النوع تحدث بنشاط في الجسم. أنها تأتي مع إطلاق الطاقة، وكقاعدة عامة، لا رجعة فيها.

تتشكل فئات فرعية من الهيدروليزات اعتمادًا على نوع الرابطة التي يتم تحللها مائيًا. وأهمها الفئات الفرعية التالية:

Hydrolases تعمل على استرات (أو استريز) تحلل استرات الأحماض الكربوكسيلية والفوسفورية والكبريتيك وغيرها من الأحماض. إنزيم واسع الانتشار لهذه الفئة الفرعية هو ثلاثي الجلسرين الليباز (هيدرولاز استر الجلسرين، EC 3.1.1.3). تسريع التحلل المائي للأسيل جلسيرول:

ممثلون آخرون عن الاستريزات يلتصقون بروابط استر في الأسيتيل كولين (أسيتيل كولينستراز)، الدهون الفوسفاتية (الفوسفوليباز)، الأحماض النووية (النوكلياز)، واسترات الفوسفات العضوية (الفوسفات).

هيدرولاز يعمل على الروابط الجليكوسيدية (الجليكوسيداز) تسريع تفاعلات التحلل المائي للسكريات قليلة السكريات، بالإضافة إلى المركبات الأخرى التي تحتوي على بقايا السكريات الأحادية (على سبيل المثال، النيوكليوسيدات). ممثل نموذجي هو سكراز (β-D-فركتوفورانوسيد فركتوهيدرولاز، EC 3.2.1.26). تحفيز تحلل السكروز:

هيدرولاز يعمل على روابط الببتيد (الببتيداز) تحفيز تفاعلات التحلل المائي للروابط الببتيدية في البروتينات والببتيدات. تشمل هذه المجموعة البيبسين، التربسين، الكيموتربسين، الكاثيبسين وغيرها من الانزيمات المحللة للبروتين. يحدث التحلل المائي للروابط الببتيدية وفقًا للمخطط التالي:

تعمل الهيدروليزات على روابط CN بخلاف الروابط الببتيدية - الإنزيمات التي تسرع التحلل المائي لأميدات الأحماض العضوية. ممثل هذه الفئة الفرعية - الجلوتاميناز (L-glutamylmidohydrolase، EC 3.5.1.2) - يشارك في الحفاظ على الحالة الحمضية القاعدية للجسم عن طريق تحفيز التحلل المائي للجلوتامين في الكلى:

لياسيس.

Lyases هي فئة من الإنزيمات التي تحفز التفاعلات غير المتحللة لانقسام الركائز مع تكوين روابط مزدوجة أو، على العكس من ذلك، إضافة في موقع كسر الرابطة المزدوجة. المخطط العام لهذه التفاعلات:

حيث A-B هي الركيزة، وA وB هما نواتج التفاعل. نتيجة لمثل هذه التفاعلات، غالبا ما يتم إطلاق مواد بسيطة، على سبيل المثال، CO2، NH3، H2 O.

الكربون الكربون لياز تحفيز كسر الرابطة بين ذرتي الكربون. فيما بينها أعلى قيمةيملك كربوكسي-لياز (ديكاربوكسيلاز)، تحت تأثير عملية نزع الكربوكسيل من الأحماض الأمينية والكيتو، لياز حمض الكيتو , والذي يتضمن سيترات سينسيز، ألدهيد لياز (ألدولاز). هذا الأخير يشمل ألدولاز ثنائي فوسفات الفركتوز (الفركتوز-1،6-ثنائي الفوسفات-د-جليسرالديهايد-3-فوسفات-لياز، EC 4.1.2.13)، تحفيز التفاعل:

لياز الكربون والأكسجين تحفيز كسر الروابط بين ذرات الكربون والأكسجين. تتضمن هذه الفئة الفرعية في المقام الأول هيدروليز, المشاركة في تفاعلات الجفاف والترطيب. على سبيل المثال سيكون ديهيدراتيز سيرين (هيدرولياز L-سيرين (التبليل)، EC 4.2.1.3)، الذي ينفذ التحول:

في بعض الأحيان يمكن اعتبار رد الفعل العكسي باستخدام المصطلح كأساس لعنوان العمل "الهيدراتيز". وبالتالي، بالنسبة لإنزيم دورة حمض الكربوكسيل L-مالات هيدرولايز (EC 4.2.1.2) فإن الاسم الموصى به هو "فومارات هيدراتاز":

لياز الكربون والنيتروجين المشاركة في القضاء على المجموعات التي تحتوي على النيتروجين. ممثل هذه الفئة الفرعية هو هيستيدين الأمونيا لياز (L-هيستيدين أمونيا لياز، EC 4.3.1.3)، يشارك في تمييع الهستيدين:

لياز كبريت الكربون تحفيز القضاء على مجموعات السلفهيدريل. تتضمن هذه الفئة الفرعية ديسولفيداز الأحماض الأمينية المحتوية على الكبريت، على سبيل المثال. السيستين ديسولفيداز (لياز كبريتيد الهيدروجين L- سيستين (التبليل)، EC 4.4.1.1).

الأيزوميراز.

الأيزوميرات هي فئة من الإنزيمات التي تعمل على تسريع عمليات التحولات داخل الجزيئات من خلال تكوين الأيزومرات. يمكن تمثيل ردود الفعل من هذا النوع بشكل تخطيطي على النحو التالي:

حيث A و A" عبارة عن مواد متصاوغة.

الأيزوميرازات هي فئة صغيرة نسبيًا من الإنزيمات؛ وهي مقسمة إلى الفئات الفرعية التالية اعتمادًا على نوع تفاعل الأيزومرات المحفز:

Racemass و epimerases تحفيز التحويل البيني للأيزومرات التي تحتوي على ذرات الكربون غير المتماثلة. سباقات تسمى الإنزيمات التي تعمل على ركائز ذات ذرة واحدة غير متماثلة، على سبيل المثال، تحويل الأحماض الأمينية L إلى أحماض أمينية D. أحد هذه الإنزيمات هو ألانين السباق (ألانين Racemase. EC 5.1.1.1)، تحفيز التفاعل:

إبيميراس تسمى الإنزيمات التي تعمل على ركائز تحتوي على عدة ذرات كربون غير متماثلة. وتشمل هذه الانزيمات UDP- الجلوكوز إبيميراز (UDP-جلوكوز-4-إيبيميراز، EC 5.1.3.2). المشاركة في عمليات التحويل البيني للسكريات الأحادية:

إيزوميرات رابطة الدول المستقلة العابرة - الإنزيمات, تسبب التغييرالتكوين الهندسي بالنسبة للرابطة المزدوجة. مثال على هذا الانزيم هو ايزوميراز ماليلاسيتواسيتات (maleylacetoacetate-cis-trans-isomerase، EC 5.2.1.2)، ويشارك في تقويض الفينيل ألانين والتيروزين وتحويل الماليلاسيتواسيتات (انظر 4.6.1) إلى فوماريلاسيتواسيتات:

إنزيمات الأكسدة داخل الجزيئات - الأيزوميرات التي تحفز التحويل البيني بين الألدوز والكيتوز. في هذه الحالة، تتم أكسدة مجموعة CH-OH مع التخفيض المتزامن للمجموعة C=O المجاورة. لذا، إيزوميراز ثلاثي الفوسفات (D-glyceraldehyde-3-phosphate-ketol isomerase، EC 5.3.1.1) يحفز أحد تفاعلات استقلاب الكربوهيدرات:

تشمل الأيزوميرات أيضًا النقل داخل الجزيئات, تنفيذ نقل مجموعة واحدة من جزء من جزيء الركيزة إلى جزء آخر من نفس الجزيء، و لياز داخل الجزيئات, تحفيز تفاعلات إزالة التدوير، وكذلك تحويل نوع من الحلقات إلى نوع آخر.

وينبغي التأكيد على أنه ليس كل العمليات البيوكيميائية. والتي تؤدي إلى الأيزومرات، ويتم تحفيزها بواسطة الأيزوميرات. وبالتالي، فإن أيزومرة حامض الستريك إلى حمض الإيزوبيمونيك تحدث بمشاركة الإنزيم هيدراتاز أكونيتات (سيترات (إيزوسيترات) هيدرولايز، EC 4.2.1.3)، يحفز تفاعل الجفاف والترطيب مع التكوين الوسيط لحمض رابطة الدول المستقلة:

إنزيمات دمج الجزيئات.

الأربطة هي فئة من الإنزيمات التي تحفز تخليق المركبات العضوية من المواد الأولية التي يتم تنشيطها بسبب انهيار ATP (أو GTP، UTP، CTP). بالنسبة للإنزيمات من هذه الفئة، يتم أيضًا الاحتفاظ بالاسم التافه سينثيتاز.فيلذلك، وفقًا لتوصيات IUBMB، لا ينبغي استخدام مصطلح "synthetases" للإنزيمات التي لا يتضمن عملها نوكليوسيد ثلاثي الفوسفات. تتم التفاعلات المحفزة بواسطة الأربطة (المركبات الاصطناعية) وفقًا للمخطط التالي:

,

حيث A وB عبارة عن مواد متفاعلة؛ A-B هي مادة تتشكل نتيجة التفاعل.

وبما أن روابط كيميائية جديدة تتشكل نتيجة عمل هذه الإنزيمات، فإن فئات فرعية من الصنف السادس تتشكل تبعاً لطبيعة الروابط المتكونة حديثاً.

الأربطة التي تشكل روابط الكربون والأكسجين. وتشمل هذه مجموعة من الإنزيمات المعروفة باسم روابط الأحماض الأمينية-tRNA (مركبات أمينواسيل-tRNA). التي تحفز التفاعلات بين الأحماض الأمينية وRNAs الناقلة المقابلة. تنتج هذه التفاعلات أشكالًا نشطة من الأحماض الأمينية التي يمكنها المشاركة في عملية تخليق البروتين على الريبوسومات. مثال على الانزيم هو إنزيم التيروزيل-tRNA (L-tyrosine: tRNA ligase (تشكيل AMP)، EC 6.1.1.1)، يشارك في التفاعل:

الأربطة التي تشكل روابط الكربون والكبريت. يتم تمثيل هذه الفئة الفرعية بشكل أساسي بواسطة إنزيمات تحفز تكوين الثيوسترات الأحماض الدهنيةمع الإنزيم المساعد A. بمشاركة هذه الإنزيمات، يتم تصنيع أسيل CoA - أشكال نشطة من الأحماض الدهنية التي يمكن أن تدخل في تفاعلات التخليق الحيوي والانهيار المختلفة. دعونا نفكر في أحد تفاعلات تنشيط الأحماض الدهنية التي تحدث في وجود الإنزيم إنزيم أسيل-CoA (حمض الكربوكسيل: الإنزيم المساعد A-ligase (تشكيل AMP). EC 6.2.1.2):

الأربطة التي تشكل روابط الكربون والنيتروجين تحفيز التفاعلات العديدة لإدخال المجموعات المحتوية على النيتروجين في المركبات العضوية. على سبيل المثال سيكون إنزيم الجلوتامين (L- الجلوتامين: الأمونيا-γ-ليغاز (تشكيل ADP)، EC 6.3.1.2). المشاركة في تحييد منتج أيضي سام - الأمونيا - في تفاعل مع حمض الجلوتاميك:

الأربطة التي تشكل روابط الكربون الكربون. ومن بين هذه الإنزيمات الأكثر دراسة كربوكسيلاز, توفير الكربوكسيلة لعدد من المركبات، مما يؤدي إلى استطالة سلاسل الكربون. وأهم ممثل لهذه الفئة هو كربوكسيلاز البيروفات (البيروفات: ليجاز ثاني أكسيد الكربون (تشكيل ADP)، EC 6.4.1.1)، تسريع تفاعل تكوين أوكسالوسيتات، وهو مركب رئيسي في دورة حمض ثلاثي الكربوكسيل والتخليق الحيوي للكربوهيدرات:

دعونا نتذكر أن التفاعلات التي تتضمن ATP يتم تحفيزها ليس فقط بواسطة إنزيمات الفئة السادسة، ولكن أيضًا بواسطة بعض إنزيمات الفئة الثانية (ناقلات الفوسفات أو الكينازات). من المهم أن تكون قادرًا على التمييز بين هذه الأنواع من ردود الفعل. الفرق بينهما هو أنه في تفاعلات الترانسفيراز يوجد ATP الجهة المانحة لمجموعات الفوسفات , ولذلك، نتيجة لهذه التفاعلات، لا يوجد إطلاق لـ H3 PO4 (انظر الأمثلة أعلاه). على العكس من ذلك، في تفاعلات التخليق يخدم ATP مصدر للطاقة , يتم إطلاقه أثناء التحلل المائي، وبالتالي فإن أحد منتجات هذا التفاعل سيكون أورثو أو بيروفوسفات غير عضوي.

قواعد العمل مع الانزيمات

الإنزيمات، مثل جميع البروتينات، هي مواد غير مستقرة نسبيا. يتم تشويهها وتعطيلها بسهولة. لذلك، عند العمل معهم، يجب استيفاء شروط معينة.

• عند تخزين كائن الدراسة لأكثر من عدة ساعات في درجة حرارة الغرفةيتم تعطيل الإنزيم بالكامل تقريبًا. ولذلك، ينبغي إجراء تحليل لتحديد نشاط الإنزيم في أقرب وقت ممكن. اذا كان ضروري تخزين طويل المدىممكن إذا تم تجفيف محلول الإنزيم من الحالة المجمدة تحت فراغ عالي (التجفيد). في هذه الحالة، يحتفظ الإنزيم بالنشاط بشكل كامل تقريبًا عند تخزينه في درجة حرارة الغرفة. يتم حفظ بعض الإنزيمات بشكل جيد في المحاليل الملحية المركزة، على سبيل المثال، في كبريتات الأمونيوم المشبعة (عملية التمليح). إذا لزم الأمر، يمكن طرد راسب الإنزيم وتذويبه في محلول ملحي أو محلول مؤقت مناسب. إذا لزم الأمر، يمكن إزالة الملح الزائد عن طريق غسيل الكلى.
• من الضروري أن نتذكر حساسية الإنزيمات للتقلبات في الرقم الهيدروجيني للبيئة. مع استثناءات قليلة، يتم تعطيل معظم الإنزيمات في المحاليل ذات الرقم الهيدروجيني أقل من 5 أو أعلى من 9، ويظهر عمل الإنزيم الأمثل في منطقة عدة وحدات أو أعشار وحدة قيمة الرقم الهيدروجيني. يوصى بتحديد الرقم الهيدروجيني للمحاليل المنظمة المستخدمة عند العمل مع الإنزيمات بدقة شديدة باستخدام مقياس الرقم الهيدروجيني.
• يتم تدمير الإنزيمات بسهولة بواسطة الكواشف القوية: الأحماض والقلويات والعوامل المؤكسدة والأملاح معادن ثقيلة. من الضروري العمل مع الكواشف النقية كيميائيًا والماء المقطر المزدوج، لأنه حتى التلوث الطفيف للكواشف، خاصة مع الشوائب المعدنية التي يمكن أن تعمل كمعدلات، يؤدي إلى تغيرات في نشاط الإنزيم.
• عند العمل مع الإنزيمات، أكثر من أي مكان آخر، من الضروري الالتزام الصارم بتوحيد شروط البحث: الصيانة الدقيقة لظروف درجة الحرارة والوقت، واستخدام الكواشف من نفس الدفعة، وعند تغيير الكواشف، يجب أن تكون البيانات التي تم الحصول عليها معايرة مرة أخرى. إذا كان اللون النامي في تفاعل اللون غير مستقر مع مرور الوقت، فمن الضروري التقيد الصارم بتوقيت القياس الضوئي.
• يوصى بالعمل في ظل ظروف التشبع الكافي للإنزيم مع الركيزة، لأن هذا الظرف يؤثر بشكل كبير النتيجة النهائية، فإن عدم وجود الركيزة يلغي الاختلافات بين الخيارات.
• عند العمل مع الإنزيمات، من الضروري أن تأخذ في الاعتبار طيف الإنزيم الخاص بالأعضاء. غالبًا ما تؤثر هذه الخصوصية على الظروف التي يعمل فيها الإنزيم. يمكن أن يتأثر مسار التفاعل باختلاف الانتماءات للركيزة، وحساسية مختلفة لدرجة الحموضة، وهي سمة من سمات الإنزيمات المتماثلة لعضو أو نسيج معين. إن نقل طريقة دراسة نشاط الإنزيم من كائن إلى آخر (على سبيل المثال، من المصل إلى الأنسجة أو من عضو إلى آخر) يجب أن يتم بحذر شديد، مع الأخذ في الاعتبار جميع البيانات المعروفة عن الإنزيم وأشكاله المتعددة، وكذلك كما التحقق بعناية من النتائج.

من أجل التنفيذ الواسع النطاق للتفاعلات الكيميائية الحيوية (الإنزيمية) المختلفة، يتم إدخال أتمتة الاختبارات الأكثر قبولًا وضرورية بشكل عام، بالإضافة إلى توحيد وتوحيد الاختبارات المعملية. وهذا أمر منطقي وضروري لتحسين دقة وجودة العينات، ومقارنة البيانات التي تم الحصول عليها في مختبرات مختلفة.

من المقبول عمومًا أيضًا إجراء دراسة موازية إلزامية، جنبًا إلى جنب مع علم الأمراض قيد الدراسة، للتحكم الفسيولوجي - مجموعة من الأشخاص الأصحاء عمليًا لتحديد التقلبات الفسيولوجية الطبيعية. لفهم النسبية لمفهوم "القيمة الطبيعية"، ينبغي قبول أنه من أجل تحديد الاختلافات في علم الأمراض وتقييم العلامة المرضية، عادة ما يتم أخذ المتوسط ​​الحسابي M ± 1σ أو 2σ (مع توزيع غاوسي طبيعي) على أنه "القاعدة" اعتمادًا على درجة تقلب المؤشر.

مبادئ تحديد نشاط الإنزيم في المواد البيولوجية.

5.6.2. خاصية فريدة من نوعهايمكن استخدام الإنزيمات لتسريع التفاعلات الكيميائية لتحديد محتوى هذه المحفزات الحيوية في المواد البيولوجية (مستخلص الأنسجة، مصل الدم، وما إلى ذلك). في ظل الظروف التجريبية المختارة بشكل صحيح، يكون هناك دائمًا تناسب بين كمية الإنزيم ومعدل التفاعل المحفز، وبالتالي، من خلال نشاط الإنزيم، يمكن الحكم على محتواه الكمي في عينة الاختبار.

يعتمد قياس نشاط الإنزيم على مقارنة السرعة تفاعل كيميائيفي وجود محفز حيوي نشط مع معدل التفاعل في محلول تحكم يكون فيه الإنزيم غائبًا أو معطلاً.

يتم وضع المادة قيد الدراسة في وسط الحضانة، حيث درجة الحرارة المثلى، الرقم الهيدروجيني للبيئة، تركيز المنشطات والركائز. في الوقت نفسه، يتم إجراء عينة مراقبة، والتي لا يتم إضافة الإنزيم إليها. بعد مرور بعض الوقت، يتم إيقاف التفاعل عن طريق إضافة كواشف مختلفة (تغيير الرقم الهيدروجيني للوسط، مما يسبب تمسخ البروتينات، وما إلى ذلك) وتحليل العينات.

من أجل تحديد معدل التفاعل الأنزيمي، عليك أن تعرف:

• الفرق في تركيزات الركيزة أو منتج التفاعل قبل وبعد الحضانة؛
• فترة حضانة؛
• كمية المواد المأخوذة للتحليل.

في أغلب الأحيان، يتم تقييم نشاط الإنزيم من خلال كمية منتج التفاعل المتكون. ويتم ذلك، على سبيل المثال، عند تحديد نشاط ناقلة أمين الألانين، الذي يحفز التفاعل التالي:

يمكن أيضًا حساب نشاط الإنزيم بناءً على كمية الركيزة المستهلكة. ومن الأمثلة على ذلك طريقة لتحديد نشاط α-amylase، وهو الإنزيم الذي يكسر النشا. عن طريق قياس محتوى النشا في العينة قبل وبعد الحضانة وحساب الفرق، يتم العثور على كمية الركيزة التي تم تقسيمها أثناء الحضانة.

طرق قياس نشاط الانزيم

هناك عدد كبير من الطرق لقياس نشاط الإنزيم، وتختلف في التقنية والنوعية والحساسية.

غالبا ما تستخدم لتحديد طرق قياس الألوان الكهروضوئية . تعتمد هذه الطرق على تفاعلات الألوان مع أحد منتجات عمل الإنزيم. في هذه الحالة، تتناسب شدة اللون للحلول الناتجة (المقاسة بمقياس الألوان الكهروضوئي) مع كمية المنتج المتكون. على سبيل المثال، أثناء التفاعلات المحفزة بواسطة ناقلات الأمين، تتراكم أحماض ألفا-كيتو، مما يعطي مركبات بنية حمراء مع 2،4-دينيتروفينيل هيدرازين:

إذا كان المحفز الحيوي قيد الدراسة ذو خصوصية عمل منخفضة، فمن الممكن اختيار الركيزة التي يؤدي تفاعلها إلى تكوين منتج ملون. ومن الأمثلة على ذلك تحديد الفوسفاتيز القلوي، وهو إنزيم منتشر على نطاق واسع في الأنسجة البشرية، ويتغير نشاطه في بلازما الدم بشكل كبير في أمراض الكبد و نظام الهيكل العظمي. يقوم هذا الإنزيم، في بيئة قلوية، بتحليل مجموعة كبيرة من استرات الفوسفات، الطبيعية والاصطناعية. أحد الركائز الاصطناعية هو فوسفات بارانيتروفينيل (عديم اللون)، والذي يتحلل في بيئة قلوية إلى أورثوفوسفات وبارانيتروفينول (أصفر).

يمكن مراقبة تقدم التفاعل عن طريق قياس شدة اللون المتزايدة تدريجيًا للمحلول:

بالنسبة للإنزيمات ذات النوعية العالية للعمل، عادة ما يكون مثل هذا الاختيار من الركائز مستحيلاً.

الطرق الطيفية بناء على التغيرات في طيف الأشعة فوق البنفسجية المواد الكيميائية، المشاركة في رد الفعل. تمتص معظم المركبات الأشعة فوق البنفسجية، وتكون الأطوال الموجية الممتصة مميزة لمجموعات معينة من الذرات الموجودة في جزيئات هذه المواد. تسبب التفاعلات الأنزيمية إعادة ترتيب داخل الجزيئات، ونتيجة لذلك يتغير طيف الأشعة فوق البنفسجية. يمكن تسجيل هذه التغييرات على مقياس الطيف الضوئي.

على سبيل المثال، تحدد الطرق الطيفية نشاط إنزيمات الأكسدة والاختزال التي تحتوي على NAD أو NADP كأنزيمات مساعدة. تعمل هذه الإنزيمات المساعدة كمستقبلات أو مانحين لذرات الهيدروجين وبالتالي يتم اختزالها أو أكسدتها أثناء عمليات التمثيل الغذائي. الأشكال المخفضة من هذه الإنزيمات المساعدة لها طيف فوق بنفسجي بحد أقصى للامتصاص عند 340 نانومتر، أما الأشكال المؤكسدة فلا تملك هذا الحد الأقصى. وبالتالي، عندما يعمل نازعة هيدروجين اللاكتات على حمض اللاكتيك، يتم نقل الهيدروجين إلى NAD، مما يؤدي إلى زيادة امتصاص NADH عند 340 نانومتر. يتناسب حجم هذا الامتصاص في الوحدات الضوئية مع كمية الشكل المخفض للإنزيم المساعد المتكون.

عن طريق تغيير محتوى الشكل المخفض من الإنزيم المساعد، يمكن تحديد نشاط الإنزيم.

طرق قياس الفلوري. تعتمد هذه الطرق على ظاهرة التألق، والتي تتمثل في أن الجسم قيد الدراسة، تحت تأثير الإشعاع، يصدر ضوءًا بطول موجي أقصر. تعد الطرق الفلورية لتحديد نشاط الإنزيم أكثر حساسية من الطرق الطيفية. جديدة نسبيا وأكثر حساسية طرق التألق الكيميائي باستخدام نظام لوسيفيرين-لوسيفيراز. مثل هذه الطرق تجعل من الممكن تحديد معدل التفاعلات التي تحدث مع تكوين ATP. عندما يتفاعل لوسيفيرين (حمض الكربوكسيل). بنية معقدة) يتم تشكيل لوسيفيريل أدينيلات مع ATP. يتأكسد هذا المركب بمشاركة إنزيم لوسيفيراز الذي يصاحبه وميض من الضوء. من خلال قياس شدة ومضات الضوء، من الممكن تحديد كميات ATP بترتيب عدة بيكومولات (10-12 مول).

طرق المعايرة . يصاحب عدد من التفاعلات الأنزيمية تغير في الرقم الهيدروجيني لخليط الحضانة. مثال على هذا الإنزيم هو الليباز البنكرياسي. الليباز يحفز التفاعل:

يمكن معايرة الأحماض الدهنية الناتجة، وستكون كمية القلويات المستخدمة في المعايرة متناسبة مع كمية الأحماض الدهنية المنطلقة، وبالتالي مع نشاط الليباز. تحديد نشاط هذا الإنزيم له أهمية سريرية.

الطرق المانومترية تعتمد على قياس حجم الغاز المنطلق (أو الممتص) في وعاء تفاعل مغلق أثناء التفاعل الأنزيمي. باستخدام مثل هذه الطرق، تم اكتشاف ودراسة تفاعلات نزع الكربوكسيل التأكسدي لأحماض البيروفيك وحمض ألفا كيتوجلوتاريك، والتي تنطلق مع إطلاق ثاني أكسيد الكربون. حاليا، نادرا ما تستخدم هذه الأساليب.

وحدات النشاط الإنزيمي وتطبيقاتها.

وقد اقترحت لجنة الانزيمات الدولية وحدة النشاطمن أي إنزيم، خذ مثل هذه الكمية من الإنزيم التي، في ظل ظروف معينة، تحفز تحويل ميكرومول واحد (10-6 مول) من الركيزة لكل وحدة زمنية (1 دقيقة، 1 ساعة) أو مكافئ ميكروي واحد للمجموعة المتضررة في الحالات التي تتم مهاجمة أكثر من مجموعة واحدة في كل جزيء ركيزة (البروتينات والسكريات وغيرها). ويجب الإشارة إلى درجة الحرارة التي يتم عندها التفاعل. يمكن التعبير عن قياسات نشاط الإنزيم بالوحدات النشاط العام والخاص والجزيئي.

للوحدة نشاط الانزيم الكلي على أساس كمية المواد المأخوذة للبحث. وبالتالي، فإن نشاط ناقلة أمين الألانين في كبد الفئران هو 1670 ميكرومول من البيروفات في الساعة لكل 1 جرام من الأنسجة؛ نشاط إنزيم الكولينستراز في مصل الدم البشري هو 250 ميكرومول حمض الاسيتيكفي الساعة لكل 1 مل من المصل عند 37 درجة مئوية.

تتطلب القيم العالية لنشاط الإنزيم في الظروف الطبيعية والمرضية اهتمامًا خاصًا من الباحث. يوصى بالعمل بمستويات منخفضة من نشاط الإنزيم. للقيام بذلك، يتم أخذ مصدر الانزيم من كمية أقل(يتم تخفيف المصل عدة مرات بالمحلول الفسيولوجي، ويتم تحضير نسبة أقل من المتجانس للأنسجة). في هذه الحالة، يتم إنشاء شروط التشبع بالركيزة فيما يتعلق بالإنزيم، مما يساهم في إظهار نشاطه الحقيقي.

يتم حساب إجمالي نشاط الإنزيم باستخدام الصيغة:

أين أ- نشاط الانزيم (الإجمالي)، ΔС- الفرق في تركيزات الركيزة قبل وبعد الحضانة؛ في- كمية المواد المأخوذة للتحليل، ر- فترة حضانة؛ ن- تربية.

يجب أن يؤخذ في الاعتبار أن مؤشرات نشاط الإنزيمات في مصل الدم والبول، التي تمت دراستها لأغراض التشخيص، يتم التعبير عنها بوحدات النشاط الإجمالي.

وبما أن الإنزيمات عبارة عن بروتينات، فمن المهم معرفة ليس فقط النشاط الإنزيمي الإجمالي في المادة التي يتم اختبارها، ولكن أيضًا النشاط الأنزيمي للبروتين الموجود في العينة. للوحدة نشاط معين خذ كمية من الإنزيم الذي يحفز تحويل 1 ميكرومول من الركيزة لكل وحدة زمنية لكل 1 ملغ من بروتين العينة. لحساب النشاط المحدد للإنزيم، من الضروري تقسيم النشاط الإجمالي على محتوى البروتين في العينة:

كلما كانت تنقية الإنزيم أسوأ، كلما زادت بروتينات الصابورة الدخيلة في العينة، انخفض النشاط المحدد. أثناء التنقية، تقل كمية هذه البروتينات، وبالتالي يزداد النشاط النوعي للإنزيم. لنفترض أنه في المادة البيولوجية الأصلية التي هي مصدر الإنزيم (الكبد المفروم، اللب من الأنسجة النباتية)، كان النشاط المحدد يساوي 0.5 ميكرومول/(ملغ بروتين × دقيقة). وبعد الترسيب التجزيئي باستخدام كبريتات الأمونيوم والترشيح الهلامي من خلال سيفاديكس، ارتفع إلى 25 ميكرومول/(ملجم بروتين × دقيقة)، أي. زاد 50 مرة. يتم استخدام تقييم كفاءة تنقية مستحضرات الإنزيم في إنتاج الأدوية ذات الطبيعة الأنزيمية.

يتم تحديد النشاط المحدد عندما يكون من الضروري مقارنة نشاط المستحضرات المختلفة لنفس الإنزيم. إذا كان من الضروري مقارنة نشاط الإنزيمات المختلفة، يتم حساب النشاط الجزيئي.

النشاط الجزيئي (أو رقم دوران الإنزيم) هو عدد مولات الركيزة التي يتم تحويلها بواسطة 1 مول من الإنزيم لكل وحدة زمنية (عادةً دقيقة واحدة). الإنزيمات المختلفة لها أنشطة جزيئية مختلفة. يحدث انخفاض في عدد دوران الإنزيم تحت تأثير المثبطات غير التنافسية. عن طريق تغيير شكل المركز التحفيزي للإنزيم، تقلل هذه المواد ألفة الإنزيم للركيزة، مما يؤدي إلى انخفاض عدد جزيئات الركيزة المتفاعلة مع جزيء إنزيم واحد لكل وحدة زمنية.

المهام التدريبية ومعايير حلها.

1. الأهداف

1. ما هي الإنزيمات التي تسمى Racemases؟

2. فك الاسم المنهجي للإنزيم (بشكل منفصل لكل عنصر، مظلل بألوان مختلفة):
S-أدينوسيل ميثيونين:جوانيدين خلات ميثيل ترانسفيراز?

يُعرِّف:
أ) نوع التفاعل؛
ب) فئة الانزيم.
ج) فئة فرعية.

2. معايير الحل

1. Racemases - الإنزيمات التي تحفز التحويل البيني الايزومرات الضوئيةتحتوي على ذرة كربون واحدة غير متماثلة (انظر القسم 2.3).

2. تتم قراءة الاسم المنهجي للإنزيم من النهاية. الانزيم ينتمي إلى الفصل نقل، يحفز رد فعل النقل مجموعة الميثيل على خلات الجوانيدين (متقبل مجموعة الميثيل) مع S-أدينوسيل ميثيونين (الجهة المانحة لمجموعة الميثيل) (انظر الأقسام 2.2 - 2.3).

3. أ) في هذا التفاعل يحدث انقسام المادة دون مشاركة جزيئات الماء

ب) يتم تحفيز الانقسام غير المائي للركيزة مع تكوين منتجين الانزيمات التي تنتمي إلى الدرجة الرابعة (اللياز)

ج) تنكسر الرابطة بين ذرات الكربون الأولى والثانية مما يؤدي إلى حذف مجموعة الكربوكسيل على شكل ثاني أكسيد الكربون. لذلك، فئة فرعية من الإنزيم - كربون-كربون-لياز(انظر القسم 2.3).